Evaluación antibacteriana de componentes estructurales internos de la almeja de mar Venus antiqua (Molusca: Bivalvia)

Mario VARGAS (1), Marjorie PARRA-LEPE (1), Guillermo BECERRA (1) & Johan QUEZADA (1)

(1) Colegio Salesiano de Valparaíso, Pasaje Don Bosco 88, Valparaíso, Chile.

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Email: profemarjo@yahoo.com.mx
Recibido el 30 de enero de 2012 / 30 demayo de 2012; Aceptado el 27 de julio de 2012; Publicado diciembre 2012

DOI: 10.7578/cienciajoven.201213

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ABSTRACT

Venus antiqua is capable of reducing the E. coli of water from an aquarium. We measured the activity of four internal structures of the clam, hepatopancreas, gills, haemolymph and digestive tract in solution for one hour (plated at 0, 30 and 60 in MacConkey agar) and disk inhibition against E.coli. Hypothetically, it was hoped that the gills and the hemolymph presented antibacterial activity, partially rejecting this hypothesis. It was determined that only the hemolymph has antibacterial activity against E. coli, and the greater the storage mechanism of the bacteria inside the animal, partially rejecting the second hypothesis. In conclusion, the evidence shows antibacterial activity of hemolymph and accumulation of bacteria from the other tissues, which is of utmost importance to determine to propose the use of this clam as a potential decontaminant biofilter and water contaminated with bacteria.

KEYWORDS: Venus antiqua, Escherichia coli, hepatopancreas, gills, haemolymph, digestive tract.


RESUMEN

Venus antiqua es capaz de disminuir las cargas bacterianas de E.coli del agua de un acuario. Se midió la actividad de cuatro estructuras internas de la almeja: hepatopáncreas, branquias, hemolinfa y tracto digestivo, en solución por una hora (plaqueando los tiempos 0, 30 y 60 en agar MacConkey) y en discos de inhibición frente a E.coli. Hipotéticamente, se esperó que las branquias y la hemolinfa presentaran actividad antibacteriana, rechazando parcialmente esta hipótesis. Se determinó que sólo la hemolinfa presenta actividad antibacteriana frente a E.coli, y que es mayor el mecanismo de almacenamiento de la bacteria en el interior del animal, rechazando parcialmente la segunda hipótesis. En conclusión, las evidencias demuestran actividad antibacteriana de la hemolinfa y una acumulación de bacterias parte de los otros tejidos, lo cual es de suma importancia determinar al proponer el uso de esta almeja como potencial biofiltrador y descontaminador de aguas contaminadas con bacterias.

PALABRAS CLAVE: Venus antiqua, Escherichia coli, hepatopáncreas, branquias, hemolinfa, tracto digestivo.


FIGURAS


 

INTRODUCCIÓN

Los  bivalvos  están  descritos  como  filtradores  y  poseen  un  sistema  inmunitario, con  hemolinfa y hemocitos, quienes han  sido  trabajados en  su actividad  fagocítica, como los estudios chilenos realizados en el ostión del norte (González & Arenas, 2007).

La respuesta inmune en moluscos está mediada por factores celulares y humorales y se ha demostrado que existe una estrecha vinculación entre estos dos componentes (González & Arenas, 2007). Estas células circulantes están presentes en la hemolinfa, pero también son capaces de salir de la circulación y migrar a otros tejidos del animal donde pueden agregarse para restringir la infección o alguna lesión tisular (Bachère et al., 2004). Su capacidad de fagocitosis es una de las funciones esenciales de los hemocitos para eliminar agentes exógenos como bacterias o protozoos (Bayne, 1990). En bivalvos pectínidos la capacidad fagocítica se ha evaluado en Pecten maximus con diversos tipos de bacterias y levaduras (Lambert & Nicolás, 1998). Cuando los bivalvos descansan en un sustrato, el animal absorbe el agua a través de la abertura o sifón inhalante. El alimento óptimo de los bivalvos sigue siendo una incógnita pero indudablemente el fitoplancton constituye la parte principal de la dieta. Otras fuentes de alimentación pueden ser importantes, como las finas partículas de materia orgánica muerta (detritus) con bacterias asociadas y materia orgánica disuelta (FAO, 2007).

Estudios realizados en el sur de nuestro país demostraron que la almeja de agua dulce, Diplodon chilensis,es un potencial organismo biofiltrador.  D. chilensis se encargó de bajar las cargas bacterianas en agua de pozo con coliformes fecales y los resultados obtenidos apoyan la idea de emplearla como un biofiltro, posible de ser incorporado en aguas pozos para depurar el agua (Lara et al., 2002).

Venus antiqua (King y Broderip 1835) (Molusca: Bivalvia)  es una almeja muy común que se distribuye en el litoral de las provincias biogeográficas peruana, centro chilena y magallánica. La distribución zoogeográfica latitudinal va desde Pucusana (18° LS) en Perú hasta el Archipiélago de Los Chonos (43° LS) en Chile y se distribuye en el nivel inferior del intermareal y submareal, desde los 2 m a los 30 m de profundidad; es comercializada a lo largo de todo el país y podría presentar las características similares a las de Diplodon chilensis. Además, puede ser cultivada en laboratorio usando una corriente suave y no necesita de amplios espacios para desarrollarse cuando vive en comunidad. Venus antiqua se alimenta de microalgas, las cuales también pueden ser fácilmente cultivables, con luz y nutrientes básicos (Brieba, 2001).

Escherichia coli es una enterobacteria descrita en el ser humano como simbionte del intestino grueso, pero además se describe como indicador de agua contaminada. Esta bacteria es contaminante también de los mares, crece en medios salinos  y es de fácil cultivo en laboratorio, donde su aislamiento se consigue usando medios sólidos selectivos de esta.

Esta investigación nace en el año 2008, el cual se ha desarrollado durante los últimos dos años, determinando que V. antiqua tiene actividad biofiltradora frente a bacterias E.coli y de agua de mar cruda, en periodos de 48 horas. El uso de mayor cantidad de almejas en un volumen determinado de agua favorece más la disminución de la carga bacteriana (Quezada et al., 2009).  A partir de esta investigación y sabiendo que la almeja disminuye las cargas bacterianas del agua del acuario, la pregunta que surge es que ocurre con la bacteria dentro de la almeja, ¿es eliminada o almacenada en alguna zona específica del animal? ¿Hay actividad inmunitaria por parte de la almeja o sólo es un mecanismo de encierro que evita contabilizarlas en el agua del acuario? Y si elimina o almacena las bacterias en su interior ¿qué factores ambientales influyen en la actividad biofiltradora de la almeja?


 

HIPÓTESIS

Si la almeja Venus antiqua disminuye las cargas bacterianas de E.coli del agua de mar en un acuario, y presenta estructuras con enzimas y actividad inmunitaria, y si el agua entra en contacto con tracto digestivo, branquias y hemolinfa, entonces las bacterias son eliminadas por la hemolinfa del animal.


 

MATERIALES Y MÉTODOS

Se obtuvo Escherichia coli desde fecas humanas cultivando en agar MacConkey en placa de petri para su identificación y cultivando en tubos de 10 ml de caldo nutritivo estéril previo a los experimentos, usando cultivos over night.

Se extrajo branquias, tracto digestivo (intestino, estómago y hepatopáncreas) y hemolinfa de 10 almejas seleccionadas desde un acuario de 20 almejas, por su condición de sifoneo en 24 hrs previo al experimento. La hemolinfa (2 ml) se extrajo con jeringa de 5 ml desde el músculo abductor posterior con suero fisiológico en una relación suero: hemolinfa 1:4, mezclándose todas las muestras. Las otras estructuras fueron extraídas, cortadas en trozos pequeños, sumergidas en 10 ml de suero fisiológico. Se preparó una batería de tubos de ensayo, mezclando 3 ml de solución problema y 2 ml de E.coli desde un caldo nutritivo over night. Se muestreó desde cada tubo 0.1 ml en placas de petri con agar MacConkey estéril en siembra homogénea en los tiempos 0, 30 y 60 minutos (con una réplica), incubándose por 48 hrs a 30°C. Se contó UFC por placa. Se plaquearon diluciones hasta 10-2.

Como control, se mezcló 3 ml de suero fisiológico con 2 ml de E.coli desde la misma muestra que los experimentales, usando el mismo procedimiento descrito para las muestras problemas.

En paralelo se midió la inhibición bacteriana con discos de inhibición (elaborados con papel filtro de 5 mm de diámetro) sumergidas en cada muestra problema: hemolinfa, branquias y tracto digestivo (intestino, estómago y hepatopáncreas), frente a plaqueos de siembra homogénea de E.coli, en placas con agar MacConkey. Como control positivo se usó discos con alcohol, y como control negativo, suero fisiológico. Cada placa fue incubada por 48 hrs a 30°C.

Para establecer la relación que existe entre las estructuras antes mencionadas y la disminución de cargas bacterianas desde un acuario, se experimentó con 6 almejas en acuario de 5 lt de agua de mar filtrada (5 micras) y esterilizada (ultravioleta) donada por la Facultad de Ciencias del Mar de la Universidad de Valparaíso. Se agregó 0,5 ml de E.coli desde un cultivo over night y 5 ml de caldo nutritivo estéril. Al tiempo cero se sacaron dos almejas desde cada acuario (2), y desde cada una se obtuvo 2 ml de hemolinfa desde el músculo abductor con jeringa estéril, tracto digestivo y branquias a partir de la disección; estos últimos tejidos fueron cortados en trozos pequeños y sumergidos en 10 ml de suero fisiológico en una placa de petri estéril. Todas las muestras fueron plaqueadas en agar MacConkey estéril en siembra homogénea (muestras directa y dos diluciones), incubando 48 hrs a 30°C y contando unidades formadores de colonias (UFC).

En paralelo, se tomó muestras desde el agua del acuario plaqueando en siembra homogénea en agar MacConkey (ambos acuarios). El procedimiento se repitió en los tiempos 5 hrs y 10 hrs. Como control se realizó el mismo procedimiento en almejas en acuarios sin Escherichia coli.


 

RESULTADOS

En todos los ensayos de hepatopáncreas, branquias y tracto digestivo mezclados con E.coli en tubos de ensayos de 0 a 60 minutos, el número poblacional de E.coli siempre fue en aumento durante la hora de medición (tasa de generación de E.coli: 30 minutos), además de la aparición de otras enterobacterias propias de cada tejido (como Klebsiella spp.). Para los ensayos de hemolinfa, se observó leve disminución bacteriana desde el tiempo 0 al tiempo 60, en menos de 500 UFC por placa.

En los ensayos con discos de inhibición, solo la hemolinfa presentó un halo de inhibición de 9 mm promedio (4 réplicas), siendo menor al halo producido por el alcohol (promedio 11 mm) (control positivo). El control suero fisiológico no presentó halo de inhibición.


DISCUSIONES

Según los resultados, se observa que las estructuras internas estudiadas: hepatopáncreas, branquias y tracto digestivo no tienen actividad antibacteriana frente a E.coli, no así la hemolinfa, que si presenta actividad antibacteriana frente a E.coli. El hepatopáncreas, ubicado a un costado del tracto digestivo y que recibe productos absorbidos por el estómago, mostró presencia de otras bacterias a parte de E.coli, por lo que se interpreta como una estructura acumuladora de bacterias y no antibacteriana. Así mismo, el tracto digestivo, a pesar de contener enzimas digestivas, no necesariamente actúan como mecanismos antibacterianos, comportándose semejante al hepatopáncreas, quien estaría en menos contacto normalmente con las bacterias que el tracto digestivo. En el caso de las branquias, donde tampoco se observa una actividad antibacteriana, se contradice con la bibliografía, que señala que tiene actividad enzimática de protección y se relaciona con la hemolinfa, permitiendo eliminar bacterias (Barnes, 1986).

Para la hemolinfa, la actividad antibacteriana está presente, complementando información bibliográfica referida a la capacidad fagocítica y mecanismos defensivos de los hemocitos y el suero de hemolinfa (González & Arenas, 2007). Si estas estructuras estudiadas, que están en contacto con la entrada de agua y son las primeras que se encuentran con bacterias que ingresan al animal, muestran no inhibición frente aE.coli (Hp, B y TD), podemos suponer que no tienen efecto antibacteriano, pero se abre el cuestionamiento si frente a otra bacteria si habría actividad. Sin embargo, los ensayos muestran presencia de otras enterobacterias en estas zonas del animal, lo que hace suponer que podrían ser simbiontes o venir desde afuera esporádicamente, no ser patógenas y acumularse en estas estructuras. En una investigación anterior de este equipo de ciencias, la almeja disminuía la carga bacteriana de E.coli en 48 hrs, no habiendo bacterias en las fecas del animal proporcionales a la disminución del agua, lo cual se justifica con la actividad antibacteriana ahora demostrada por los ensayos de inhibición. La propuesta de este estudio es que las bacterias ingresan al animal, se acumulan en estructuras, como branquias, intestino o hepatopáncreas, para lentamente ser eliminadas por la hemolinfa, que funciona en un sistema circulatorio abierto y posee células capaces de moverse hacia otros tejidos (González & Arenas, 2007).

Esto se apoya con los resultados obtenidos en el tercer experimento (tercer gráfico), donde  los valores de UFC por placa disminuyen en el agua del acuario, en la hemolinfa y en las branquias al cabo de 10 hrs, y aumenta en la zona del tracto digestivo, sugiriendo que el tracto acumula bacterias y no las elimina, lo que explicaría la disminución de bacterias en el agua del acuario. Sin embargo, por resultados obtenidos por Quezada et al. (2009), sabemos que las bacterias no salen vivas desde la almeja dentro de las 48 hrs. Esto se puede explicar por una actividad de la hemolinfa posterior, que impediría la salida de bacterias vivas desde la almeja. Los resultados muestran que las branquias no acumulan bacterias y los discos de inhibición muestran que no hay actividad antibacteriana en esta zona.

Es así como aceptamos la primera hipótesis, debido a que los resultados muestran que la hemolinfa  tiene actividad antibacteriana y que las otras estructuras solo almacenan la bacteria. Se sugiere medir la disminución de las cargas bacterianas en acuario a largo plazo (más de 48 hrs), para determinar si al cabo de un tiempo las bacterias excedentes salen a través de las fecas del animal.


 

CONCLUSIONES

La almeja Venus antiqua es capaz de bajar las cargas bacterias de E.coli en el agua de mar de un acuario (Quezada et al., 2009), lo cual estaría relacionado al almacenamiento de las bacterias en zonas como el tracto digestivo, y en un menor grado la eliminación de estas bacterias por acción antibacteriana de la hemolinfa. Se cumplen los objetivos al determinar estructuras asociadas al mecanismo antibacteriano, como la hemolinfa, y que el mecanismo de disminución de bacterias del agua estaría dado principalmente por una acumulación de las mismas más que eliminación. La hipótesis es aceptada. Sin embargo, es necesario ampliar el estudio a otros tipos bacterianos y determinar si las fecas de las almejas presentan bacterias después de 48 hrs, lo que validaría el supuesto de que hay un claro almacenamiento. Esto tiene relevancia a la hora de proponer el uso de Venus antiqua como biofiltrador natural, ya que si se pretende descontaminar aguas contaminadas con bacterias, es necesario que la almeja elimine las bacterias y no las almacene para enviarlas al agua de nuevo mas tarde.


 

AGRADECIMIENTOS

A Pablo Bonati y el Centro de Investigación Científica de Quintay de la UNAB, CIMARQ; a la profesora Chita Guisado y Roberto Maltraín de la Facultad de Recursos Naturales y Ciencias del Mar de la Universidad de Valparaíso, y al Dr. Erwin Strashburger de la UTFSM, por la guía, orientación y entrega de materiales e individuos en estudio. Al Colegio Salesiano Valparaíso por abrir espacios de desarrollo de las ciencias escolares. A Faviola Jorquera, profesora de Matemáticas del CSV, por su apoyo en los análisis matemáticos de este proyecto. A  Fundación Ciencia Joven.


 

REFERENCIAS

1. Bachère, E., Y. Gueguen, M. Gonzalez, J. de Lorge-ril, J. Garnier & B. Romestand. (2004). “Insights into the anti-microbial defense of marine invertebrates: the penaeid shrimps and the oyster Cras-sostrea gigas”. Immunol. Rev., 198: 149-168.

2. Barnes, R. (1986). “Zoología de Invertebrados”. 4ta Edición.

3. Bayne, C.J. (1990). “Phagocytosis and non-self recognition in invertebrates. Phagocytosis appears to be an ancient line of defence”. Bioscience, 40: 723-731.

4. BRIEBA, Claudio, [online] (2001). “Microalgas usadas en acuicultura” Unap.cl URL: http://www.unap.cl/~cbrieba/micro._acui.htm.

5. González, Marcelo & Arenas, Gloria. (2007). “Modificación de los parámetros inmunitarios hemolinfáticos en el ostión del norte (Argopecten purpuratus, Lamarck, 1819) afectados por el cuadro de retracción del manto”. Invest. Mar., Valparaíso, 35(1): 3-12.

6. Lambert, C. & J.L. Nicolas. (1998). “Specific inhibition of chemiluminescent activity by pathogenic vibrios in hemocytes of two marine bivalves: Pec-ten maximus and Crassostrea gigas”. J. Invertebr. Pathol., 71(1): 53-63.

7. LARA, Gladys, CONTRERAS, Angel y ENCINA, Francisco. (2002). “La almeja de agua dulce diplodon chilensis (bivalvia:hyriidae) potencial biofiltro para disminuir los niveles de coliformes en pozos: experimento de laboratorio”. Gayana (Concepc.). Vol.66, no.2, p.113-118. URL: http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0717-65382002000200005&lng=es&nrm=iso . ISSN 0717-6538.

8. Quezada, J., Giacaman, B., Parra, M. (2009). “Estudio de la actividad biofiltradora de la almeja de agua de mar Venus antiqua frente a bacterias”. VI Congreso Regional de Ciencia y Tecnología Programa Explora, Región de Valparaíso.

9. RAMIREZ, Jesús, CONTRERAS, Gabriel y GOMEZ, M Carmen. (2005). “La fase estacionaria en la bacteria Escherichia coli”. Revista Latinoamericana de Microbiología. URL: http://www.medigraphic.com/pdfs/lamicro/mi-2005/mi05-3_4f.pdf

10. Uriarte,  I.  (2008).”Estado  actual  del  cultivo  de  moluscos  bivalvos  en  Chile.”  (Online) URL:ftp://ftp.fao.org/docrep/fao/011/

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